石棉表露下内质网应激在肺泡上皮细胞凋亡中的效率机制

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石棉表露下内质网应激在肺泡上皮细胞凋亡中的效率机制

周煦 刘刚

广东医学院广东湛江524023

通信作家:刘刚

基金名目:国度天然科学基金(编号:81172615),广东省天然科学基金(编号:S2012010008299),广东医学院青年基金名目(编号:Q2012016)

【纲要】手段商量石棉表露下内质网应激在细胞凋亡中的效率机制。本领运用石棉处置A549细胞,免疫性荧光染色免疫性法和免疫性印迹法查看内质网应激(ERS)关系卵白与促凋亡基因的变革。截止石棉表露下,ERS关系卵白Bip、IRE?1α和GRP94,以及促凋亡基因BAX、BAK卵白表白均上调,且与石棉表露功夫呈正关系。结论内质网应激介入了石棉开辟的细胞凋亡。

【 关键字】石棉 内质网 应激 凋亡

内质网是细胞内要害的细胞器,内质网功效的伤害可惹起内质网应激(Endoplasmic Reticulum Stress,ERS),长久过强的内质网应激开辟内质网关系性细胞凋亡。此前的接洽提醒线粒体调节和控制的细胞凋亡是石棉惹起细胞凋亡的重要道路[1],ERS介导的细胞凋亡是比年新创造的凋亡道路,比年ERS所启用的凋亡道路以其特出的场所遭到越来越多的关心。因为肺泡上皮细胞(Alveolar Epithelial Cell,AEC)的凋亡代表了一个耐性肺间质纤维化的早期振动,而石棉肺早期的病理变革一致于特发性肺间质纤维化(Idiopathic Pulmonary Fibrosis, IPF)[2-3],所以咱们以AEC动作接洽东西商量石棉惹起AEC凋亡的简直机制。

1材料与本领

1.1材料

人肺腺癌上皮细胞株A549购于American Type Culture Collection(ATCC)。DMEM、FBS(GIBCO Invitroge公司);BIP,IRE?1α,GRP94,BAK,BAX抗体(Cell Signaling Technology公司);β?actin(Santa Cruz公司)。

1.2仪器

激光共聚焦显微镜体例TCS SP5 II(Leica公司);荧光成像体例VersaDocMP5000(Bio?Rad公司);生物培植箱Thermofisher144L(Thermo公司);高速离心术Minispin(Eppendorf公司);电热恒温水箱CU420(Julabo公司)。

1.3本领

1.3.1细胞培植惯例DMEM培植基(含10%胎牛血清)培植。

1.3.2石棉处置采用不锈钢铰剪将石棉(产于青海芒崖)纤维状矿物质料剪碎,PBS配成5 mg/ml浓度的悬浊液,经超声分别与充溢振动混匀,高压蒸汽灭菌后备用。石棉纤维的分别度大概70%为可吸入(2~5 μm)。

1.3.3免疫性荧光染色甲醛固定细胞,运用Triton?X?100使限制膜卵白变性,羊血清封锁,一抗孵育过夜,越日荡涤三次,每次10 min,介入二抗,2 h后荡涤,介入抗荧光淬灭剂后封片,激光共聚焦显微镜查看、收集图像。

1.3.4统计学本领采用spss 10?0软件进行领略统计。所得数据以(±s)表白,组间比拟运用方差领略及q检查。p<005觉得有明显性分别。

2截止

石棉处置A549细胞后,ERS标记卵白Bip、IRE?1α和GRP94,以及促凋亡基因BAX、BAK卵白表白均上调,且与石棉表露功夫呈正关系。

3计划

内质网经过激活未折叠卵白反馈 (Unfolded Protein Response,UPR)以保护由内质网应激所惹起的细胞伤害[4],激动内质网对储存在网腔内的缺陷折叠或未折叠卵白质的处置,有利于保护细胞的平常功效并使之存活,但是即使伤害太过重要以至底细况宁静不能及时回复,内质网应激不妨惹起细胞凋亡,旗号就会由促存在向促凋亡变换[5-6]。

Bip是位于内质网的要害分子伙伴,与很多内质网卵白都有短促的彼此效率,是内质网保护底细况稳态的一个感触器,介入安排内质网钙离子内稳态等诸多生物学进程。截止表露:石棉处置A549细胞后,经过检验和测定动作ER稳态领会器以及UPR标记卵白的Bip(Immunoglobulin Binding Protein,or Glucose Regulating Protein,又称为GRP78),免疫性印迹截止表露该卵白表白上调,且与效率功夫呈正关系,提醒ERS介入了石棉惹起的细胞凋亡。IRE-1(Inositol-Requiring Enzyme 1)通路是ERS开辟的细胞旗号转导通路的三大通路之一,IRE-1领会ERS的进程与Bip的游离相关。当ER稳态失衡,展现洪量未折叠卵白会合,Bip与IRE-1解离,转而与未折叠卵白贯串,激动卵白质的精确折叠。当ERS反馈程度过强或贯穿功夫过长时,伤害超过建设本领, IRE-1可启用凋亡机制,开辟细胞凋亡。GRP94动作应激卵白,大概也与细胞凋亡存在确定的接洽[7]。

长久此后,大多接洽觉得AEC凋亡重要经过线粒体道路和牺牲受体道路介导[8-9],而咱们迩来的接洽创造:石棉表露下,A549细胞(具备AEC个性)上ERS标记卵白IRE-1和GRP94表白上调,进一步证明ERS道路介入了石棉惹起的细胞凋亡。咱们还创造A549细胞经石棉处置后,Bcl-2家属中具备激动细胞凋亡效率的BAX、BAK[10]的表白与ERS关系卵白的表白呈正关系,已有汇报表露BAX和BAK大概经过与IRE-1α的直接效率来调节和控制UPR[11]。

细胞凋亡本人具备两面性,同样具备两面性的ERS惹起细胞凋亡时,旗号会由促存在向促凋亡变换,该变换简直经过什么道路实行?石棉表露下,ERS开辟的细胞凋亡道路的很多方面仍未精确,须要咱们更进一步的接洽表明该细胞凋亡道路的调节和控制机制。

参考文件

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