果蝇神经粘附分子Neuroligin4钓饵卵白载体的建立

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果蝇神经粘附分子Neuroligin4钓饵卵白载体的建立

林子英 任妮娜 刘刚

【纲要】手段 建立果蝇神经粘附分子Neuroligin4钓饵卵白载体。本领按照Neuroligin4基因的特性,辨别安排胞外段和胞内段的引物序列,经过PCR、酶切等本领将手段片断接入钓饵载体中。截止

经酶切和测序审订,成功建立Neuroligin4胞外端和胞内端钓饵卵白质粒。结论Neuroligin4钓饵载体的成功建立为接洽Neuroligin4基因的功效奠定了基础。

【 关键字】Neuroligin4 神经粘附分子 钓饵载体

【Abstract】Objective

To construct the bait protien of drosophila neural adhesion molecule Neuroligin4. Methods

Respectively according to the characteristics of the Neuroligin4 genes, we designed primer sequences of extracellular and intracellular, and connected purpose fragment with bait plasmid by PCR and enzyme digestion, etc. Results

With identification by the enzyme digestion and sequencing appraisal array, the Neuroligin4 extracellular and intracellular bait plasmids were successfully contructed. ConclusionNeuroligin4 bait carrier successfully building has paved the way for the function research of Neuroligin4 gene.

【Key words】 Neuroligin 4, Neural adhesion molecule, Bait carrier

【Author′s address】Guangdong Medical College, Zhanjiang, Guangdong, 524023, China

doi:10.3969/j.issn.1671-332X.2014.12.005

开始的接洽创造,独立症存在染色体特殊,既而经过连锁领略法更加深刻商量了关系基因的效率。迄今为止,已精确的伴有独立症表型的单基因遗传病有Angelman归纳症、Tett归纳症、脆性X归纳症、结节性强硬症等。对于独立症神经生物学的接洽,会合在突触可塑性上,觉得树突的发育特殊大概启发独立症的爆发。接洽创造编码重心的跨突触成分Neurexin/Neuroligin/PSD-95/ SAPAP/ Shank的基因都是独立症的易感基因。 Neuroligin动作Neurexin的配体,在突触的发育产生,功效保护起着极端要害的效率。Neuroligin家属卵白大学一年级致在神经体例表白,并且在人类、哺乳动物、小鼠、线虫、果蝇等体例中都有不同的同源基因。Neuroligins是典范的单跨膜卵白,它们包括4个不同的构造域:位于N端的可被切除的旗号肽、一个乙酰胆碱酯酶一致构造域(但是没有催化活性)、一个高度顽强的单跨膜构造域和一个短的细胞内序列PDZ贯串基序(具备高度顽强的C终局序列)。经过生物消息领略创造,果蝇中存在着四个编码Neuroligin分子的基因,辨别定名为DNlg1,DNlg2,DNlg3和DNlg4。他们与人类Neuroligin1的同源性辨别是19.3%,22.4%,25.9%,22.2% [1]。个中,DNlg1和DNlg2都有相映的报道,它们对突触产生,突触后分裂有提防要的感化 [2-4]。近期果蝇Neuroligin4(CG34139)基因接洽尚无报导,它何如调节和控制其左右游卵白以及在神经突触爆发的机制尚有待进一步接洽和表明。本接洽以Neuroligin4的胞外端和胞内端片断动作钓饵卵白体制,试渔利用这个别系经过酵母双杂交本领[5] 从果蝇cDNA文库中挑选与Neuroligin4彼此效率的卵白,对于进一步表明DNlg4在体内的心理功效具备宏大概义。

1材料与本领

1.1材料

果蝇Neuroligin4 cDNA模板、pGBKT-7、pGBT-9、大肠杆菌DH5a由本试验室存在。LB培植基,氨苄抗生素,卡那抗生素由上海生工生物公司购置。百般控制性内切酶、T4 DNA贯穿酶、Taq DNA会合酶、dNTPs等由TaKaRa公司购置。引物及克隆测序均由英潍捷基公司供给,其余试剂均为国产领略纯。

1.2仪器

PCR仪5531,高速离心术(Eppendorf公司);凝胶成像领略仪GDS800(UVP公司);生物培植箱Thermofisher144L(Thermo公司)等。

1.3本领

1.3.1PCR扩大与增加手段片断参考Flybase登录的Neuroligin4 基因的cDNA序列辨别安排N端和C端片断引物,N端上游引物序列为:5′-AACGAATTCATGGGGGAAAGTCAGCTGCT-3′(下划线为EcoR I酶切位点),卑劣引物为5′- ATCCTGCAGGCAGGGCCGTCGAATAGGCCG- 3′(下划线为Pst I酶切位点);C终局上游引物为- AACGAATTCCAGCGCGACAAGACGCGGCT -3′(下划线为EcoR I酶切位点),卑劣引物为5′- ATCGTCGACGGACGCGCATCTCGTCCATCG-3′(下划线为Sal I酶切位点)。PCR反馈体制50 μl:高保真DNA Taq酶0.5 μl,cDNA 1 μl。扩大与增加前提:58 ℃退火30 s,72 ℃蔓延,每个轮回蔓延30 s,30个轮回反馈。结果琼脂糖电泳,胶接收手段条带。

1.3.2手段片断与钓饵载体的酶切与贯穿将扩大与增加产品与钓饵载体pGBKT-7辨别用EcoR I和Pst I酶切,获得的酶切产品进行琼脂糖电游泳皇后接收。获得的酶切产品进行贯穿,体制20 μl:DDW 11.5 μl,10XLigase Buffer 2 μl,载体 3 μl,手段片断 3 μl,T4贯穿酶6 μl。16 ℃过夜贯穿。

1.3.3变化和克隆审订获得的贯穿产品变化至DH5a领会态中,过夜培植12 h后,挑取单克隆挑选重组质粒,双酶切进一步考证。考证后的质粒送至测序。

2截止

果蝇Dneuroligin4基因位于果蝇3号染色体的右臂92D5-8,由17个外显子,12个内含子构成。基因全长40 665 bp,个中CDS为3 843 bp,不妨编码1 281个氨基酸,估计表白卵白分子经糖基化等化装后大小约为140 kD。它的卵白包括一个长的胞外端,个中含有一个较大的类乙酰胆碱酯酶构造域,因其确定酯酶活性的重要位点的丝氨酸转产生了甘氨酸,所以,这个构造域不完备酯酶活性。在跨膜区的胞外端是一段含有多个糖基化位点的地区,在跨膜区的胞内端是一段奇异性较高的无规弯曲地区,如图1A。在C终局是一个顽强的ELRV序列,是典范的PDZ贯串基序。

基于DNlg4的定位和传播,不妨决定DNlg4是一个神经关系卵白,又因为DNlg4是一个I型跨膜卵白,所以所有卵白不适实用于酵母双杂交体例。但是由于胞外端和胞内端的构造和功效悬殊,不妨将其分为胞外端和胞内端两个限制辨别来接洽。以是咱们将DNlg4卵白分为两限制当做钓饵卵白去筛库,既能明显简直定卵白彼此效率的Domain,又能估计DNlg4各限制功效,最后实行所有卵白功效的估计,如图1A。

DNlg4胞外端所安排的引物位于开始暗号子到2 472 bp处,引入EcoR I和Pst I酶切位点,开始用PCR本领从全长cDNA中扩大与增加手段片断,并将其接入pGBKT7钓饵载体中,变化获得克隆,经EcoR I和Pst I双酶切审订,条带约为2 500 bp,与手段片断大小普遍,如图1B。

DNlg4胞内端所安排的引物位于2 542 bp到中断暗号子处,引入EcoR I和Sal I酶切位点,开始用PCR本领从全长cDNA中扩大与增加手段片断,并将其接入pGBT9钓饵载体中,变化获得克隆,经EcoR I和Sal I双酶切审订,条带约为1 300 bp,与估计大小普遍,如图1C。

3计划

2011年10月KNIGHT D等[1]对果蝇中Neuroligin和NRX作了关系的报道,对DNl1和DNl2的表型和功效作了相映的比拟。2010年DANIEL等[1]揭穿果蝇Neuroligin1不妨在谷氨型NMJ中激动成长和突触后分裂的效率。他指出,DNl1的null渐变表型惹起NMJ中突触Bouton数目的大幅度减少,以及神经递质的开释量也鲜明低沉。当DNl1缺点和失误的情景下,突触后分裂鲜明展现妨碍。而当Dnl1胞内构造域缺点和失误(即DNl1-GFP△cyto)的情景下,表露出鲜明的显性负效力局面。这是由于DNl1-GFP△cyto仍旧保持了胞外端限制,使得DNl1仍旧不妨产生复合体,但是本人仍旧遗失功效。固然胞外端不妨与NRX彼此效率起到很要害的效率,但是胞内端的效率犹如对DNl1的功效及对突触前Bouton是必定的。这是因为胞内端限制不妨与突触后膜下骨架卵白彼此效率,这个结论仍旧在哺乳动物中已被证明。比方NL2就能在控制型突触GABAergic与PSD卵白Gephyrin和Collybistin彼此效率。接着,2011年SUN等[2]公布了对于DNl2的报道。DNl2缺点和失误渐变身体表面露出NMJ表型的很多构造性缺点,展示为轴突管分支的减少和突触Bouton数目的减少,但是神经递质的开释量减少,每个Bouton中AZs数目的减少但是SSR厚度变小。还展示出突触后谷氨酸受体数目的减少,以及谷氨酸受体组分散生变换。Null渐变体的这些表型不妨被突触后Dnl2的表白所救济。他还表明了DNl2真实不妨与突触前的Nrx彼此效率。当DNl2和DNRX双渐变的情景下展现蛹期致死或突

图1酶切审订截止

A: Dneuroligin4(DNlg4)基因组构造特性以及DNlg4的胞外端ECD和胞内端ICD的采用片断;

B: 酶切检验和测定pGBKT7-DNlg4-ECD重组质粒;

C: 酶切检验和测定pGBT9-DNlg4-ICD重组质粒。

触发育妨碍等表型。这些试验证明表白,DNl2是突触后熟习和功效所必需的分子。暂时,海表里对Neuroligin4的基因功效做了洪量的接洽,但是对Neuroligin4真实功效的探究的报道比拟较较单薄。

综上所述,本接洽按照Neuroligin基因构造的特性,辨别截取胞外段和胞内段,去掉跨膜构造,安排引物,将这两段序列经过PCR、酶切的办法接到钓饵载体上,测序截止表露所得的两个克隆与手段序列比对成功,表白咱们成功博得了Neuroligin基因的两个钓饵卵白质粒,为后续接洽Neuroligin基因的功效供给了杰出的基础。

参考文件

[1]KNIGHT D, W XIE, G BOULIANNE. Neurexins and Neuroligins: Recent Insights from Invertebrates[J]. Molecular Neurobiology, 2011,44(3): 26-440.

[2]SUN M, XING G, YUAN L,et al.Neuroligin 2 Is Required for Synapse Development and Function at the Drosophila Neuromuscular Junction[J]. The Journal of Neuroscience, 2011,31(2): 687-699.

[3]BANOVIC D, KHORRAMSHAHI O, KHORRAMSHAHI O, et al.Drosophila Neuroligin 1 Promotes Growth and Postsynaptic Differentiation at Glutamatergic Neuromuscular Junctions[J]. Neuron, 2010,66(5): 724-738.

[4]IIDA J, HIRABAYASHI S, SATO Y, et al.Synaptic scaffolding molecule is involved in the synaptic clustering of neuroligin[J]. Molecular and Cellular Neuroscience, 2004,27(4): 497-508.

[5]WALLACH D, BOLDIN M P,KOVALENKO A V,et al. The yeast two-hybrid screening technique and its use in the study of protein-protein interactions in apoptosis[J]. Current Opinion in Immunology, 1998,10(2):131-136.

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